*Corresponding author: Ji-An Lee Tel : +82-2-940-7821 E-mail : I. 서 론
멜라닌 생성(melanogenesis)은 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 방어기전 중 하나로 자외선 조사 후 멜라닌 형성세포(melanocyte)에서 멜라노좀(melanosome)의 형태로 생성되고, 이는 각질세포로 이동하여 색소 침착을 유발한다.
특히 생합성은 멜라닌 세포 내 세포 소기관인 멜라노좀에서 복잡한 일련의 단계를 통해 일어나며 티로시나아제에 의해 촉매된다(Slominski et al., 2022). 자외선에 의해 피부 각질 세포(keratinocyte)가 자극을 받게 되면 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone), adrenocorticotropic hormone(ACTH) 등의 신호전달 물질들이 멜라닌 세포로 분비된다. 멜라닌 세포 막에 존재하는 수용체인 MC1R(melanocortin 1 receptor)은 신호전달 물질들을 인지하여 세포 내 cyclic adenosine monophosphate(cAMP)를 증가시키고 그 결과 protein kinase A(PKA)가 활성된다(Qian et al., 2020). 증가된 cAMP는 AMPresponsive element binding protein(CREB) 인산화를 촉진시키고 이는 전사 인자인 MITF의 발현을 증가시키고, tyrosinase의 발현을 유도함으로써 멜라닌 생성을 증가시킨다. 따라서 MITF, tyrosinase, TRP-1과 TRP-2의 활성 억제 효능은 멜라닌 생성을 저해시키고 미백 효능을 증진하는데 중요한 역할을 한다(Hida et al., 2020).
멜라닌 생합성 첫 번째 단계에서 중요한 효소인 tyrosinase는 tyrosine을 산화시켜 L-3,4-dihydroxyl-L-phenylalanine(L-DOPA)로, 다시 L-DOPA를 DOPA quinone으로 산화시키는 과정을 촉진시킨다. 이후 TRP-1은 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid(DHICA)를 carboxylated indole-quinone으로 변환시키며, TRP-2는 DOPA quinone을 DHICA로 전환하는 것으로 알려져 있다(Hassan et al., 2023).
최근까지 화학성분 미백제에 의한 부작용으로 인해 천연자원 유래 생리학적 활성 성분의 안전한 미백제 개발 필요성이 대두됨에 따라 천연식물 내 존재하는 tyrosinase 억제제에 의한 Tyrosinase 활성저해, L-DOPA 산화억제 및 멜라닌 생성 저해능을 통한 새로운 미백제 개발 연구는 꾸준히 진행되고 있는 실정이다(Hwang & Lee, 2007; Hanif et al., 2020).
미라클프룻(Synsepalum dulcificum Daniell [Sapotaceae])은 mysterious fruit으로도 알려져 있으며 상록 열대 식물로 아프리카 서부가 원산지이다. 특히 열매는 쓴맛을 단맛으로 변화시키는 독특한 특성과 함께 과피의 붉은 색소는 천연 식용 색소 원료로서 활용되며(Kurihara and Beidler, 1986; Chen et al., 2006), 최근에는 부탄올 분획물에 의한 고요산혈증(Hyperuricaemia) 치료제로서의 효능이 보고되었다(Shi et al., 2016). 또한 미라클프룻 잎 80% 메탄올추출물은 당뇨 2형 쥐에서 항비만 효능(Obafemi et al., 2017; Obafemi et al., 2019)과 zebrafish model과 mouse model에서 각각 종양신생 혈관(antiangiogenesis) 활성 및 유방암 세포주 MCF-7 세포의 암세포 성장을 억제하는 항암 효능이 알려져 있다(Ma et al., 2022). 그러나 아직까지 미라클프룻의 씨앗과 잎을 소재로 화장품 원료로서의 효능을 평가한 연구는 매우 미비한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 미라클프룻 씨앗과 잎 메탄올추출물의 DPPH 혹은 ABTS 라디컬 소거 활성과 추출물 내 총 폴리페놀 함량 측정을 통해 항산화 효능을 조사하고 in vitro tyrosinase 활성 억제능, DOPA 산화반응 저해능, α-MSH로 자극한 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성량 감소, 마지막으로 멜라닌 생성 관련 유전자의 mRNA와 단백질 발현 수준 측정을 통한 미백활성을 검증하여 기능성 천연 화장품 소재로서의 적용 가능성을 평가하고자 하였다.
II. 재료 및 방법
1. 물질추출 방법
본 연구에서 사용된 미라클프룻은 호북(湖北, Hubei)성 십언(十堰, Shiyan)시에서 재배되어 건조된 것을 Taobao(https://main.m.taobao.com)로부터 구매하여 추출에 사용하였다. 분쇄한 미라클프룻 씨앗과 잎을 각각 10 g, 30 g에 70% methanol을 시료 중량의 10배가 되도록 첨가하여 상온에서 24시간 침지하였다. 상등액과 침전물을 분리하기 위해 여과(Whatman No.2)한 후 감압농축하고 동결건조하여 최종분말 형태의 시료를 획득하였다. 그 결과 미라클 씨앗 메탄올추출물(S. dulcificum seed, SDS)의 최종분말 중량은 2.84 g, 잎 메탄올추출물(S. dulcificum leaf, SDL)은 7.41 g으로 확인되었다. 추출 수율은 추출 전 시료의 중량에 대한 추출 후 시료의 중량을 백분율로 환산하여 계산하였다.
2. Total polyphenol content assay
총 폴리페놀 함량 분석은 대표적인 폴리페놀 성분인 gallic acid를 표준물질로 Folin-Ciocalteu 방법에 따라 측정하였다. 추출물 희석 시료와 Folin-Ciocalteu를 혼합하여 5분간 방치한 후 10% Na2CO3를 첨가하였다. 암 조건하에서 50분 동안 방치한 후 원심분리 하였다. 상등액을 회수하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출물 1 g 건조 중량에 대한 mg gallic acid equivalent(GAE)로 환산하여 나타내었다.
3. Radical scavenging activity assay
1) DPPH assay
전자공여능(EDA: electron donating ability)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다(Blois, 1958). DPPH 음이온 라디컬 용액은 메탄올에 용해시켜 100 mM로 제조하였으며, 표준물질 L-ascorbic acid 또는 각 농도별로 희석한 시료와 1:1(v/v)로 섞어 상온에서 반응시켰다. 30분 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하여 추출물 무첨가구에 대한 추출물 첨가구의 흡광도비로 추출물에 함유된 DPPH 라디컬 소거 활성을 백분율(%)로 나타냈었다.
2) ABTS assay
ABTS+ cation decolorization assay 방법은 ABTS 양이온 라디컬을 사용한 친수성 또는 친유성 물질의 항산화 효능을 측정하는 분석법이다(Roberta et al., 1999). 산화제인 2.35 mM potassium persulfate를 7 mM의 ABTS(2,2-azinobis(3-ethylbenthiazoline-6-sulfonic acid) 수용액에 첨가하여 18시간 동안 반응시킨 결과 생성된 ABTS+ 라디컬을 표준물질 L-ascorbic acid 또는 각 농도별로 희석한 시료와 1:1(v/v)로 섞어 상온에서 반응시켰다. 30분 후, 734 nm에서 흡광도를 측정하여 추출물 무첨가구에 대한 추출물 첨가구의 흡광도비로 추출물에 함유된 ABTS 양이온 라디컬 소거 활성을 백분율(%)로 나타냈었다.
4. Cytotoxicity assay
1) Cell culture
본 실험에 이용한 RAW264.7(mouse macrophage cell)은 dulbecco’s modified eagle medium(DMEM) 배지에 최종농도 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin/streptomycin(100 U/ml)을 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
2) WST-8 cell viability assay
Cell viability 측정은 바이오맥스 사에서 구매한 WST-8 assay kit를 사용하여 수행하였다. 쥐 대식세포주(RAW264.7)와 쥐 흑색종 세포주(B16F10)를 각각 96 well plate에 1×105 cells/well을 100 μl씩 분주하고, 시료를 농도 별로 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 여기에 WST-8 용액을 최종 10% volume으로 첨가하여 2시간 추가 배양하고 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물 첨가구와 무첨가구인 대조군을 비교하여 세포 생존율(% control)을 계산하여 세포 독성 유무와 정도를 측정하였다.
5. In vitro tyrosinase inhibition assay
Tyrosinase 저해활성 측정은 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.5) 80 ㎕, 시료 10 ㎕, mushroom tyrosinase(1500~2000 U/mL) 20 ㎕, 1.5 mM L-tyrosine 40 ㎕를 혼합하였다. 혼합액을 37℃에서 15분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 추출시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 배분율 (%)로 나타내었다.
6. In vitro DOPA oxidation inhibition assay
DOPA에 대한 in vitro tyrosinase 저해 시험은 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 7.0) 80 ㎕, 시료 10 ㎕, mushroom tyrosinase(1500~2000 U/mL) 10 ㎕을 혼합하여 상온에서 5분 반응시킨 후, 2.5 mM L-DOPA 30 ㎕를 첨가하여 37℃에서 2분간 추가 반응하고 475 nm 에서 흡광도를 측정하여 추출시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 배분율(%)로 나타내었다.
7. Melanin 생성 저해능 측정
Melanin 생성량 측정은 Hosoi 등의 방법을 변형하여 사용하였다(Hosoi et al., 1985). B16F10 세포를 배양하여 24 well plate에 각 well당 세포를 1×105 cells/well로 24시간 배양하였다. 새로운 배지로 교체한 후 200 nM의 α-MSH와 추출물을 농도별로 48시간 처리하였다. 배양액을 제거한 이후 각 well의 세포를 PBS로 2차례 세척한 후, 멜라닌 색소를 용해시키기 위해 0.2 N NaOH용액 400 ㎕를 각 well에 첨가하고 60℃에서 1시간 동안 용해한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Melanin 생성 저해능은 각 추출물을 농도별로 처리하여 측정한 실험군의 흡광도 값과 α-MSH만을 처리한 대조군과의 흡광도 값의 차를 구하여 백분율(%)로 나타내었다.
8. Western blot을 통한 단백질의 발현 측정
MITF, tyrosinase, TRP-1 미백 관련 인자들의 활성을 알아보기 위해 B16F10 세포를 60 mm culture dish에 1×106 cells/dish씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 PBS로 2회 세척해주었다. 세포에 proteinase inhibitor cocktail을 포함한 RIPA buffer를 첨가하고 30분간 용해시킨 후 4℃에서 13,200 rpm, 20분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층 액은 Bradford solution을 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질 분리를 위해 10% SDS-PAGE을 사용하여 전기 영동 후, gel 상의 단백질을 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane으로 이동시키고 blocking buffer(5% skim milk in TBST)에서 30분간 blocking을 수행하였다. 1차 항체는 4℃에서 overnight 반응시키고 2차 항체는 상온에서 1시간 반응시켰다. 항체를 세척하기 위해 0.05% TBST로 10분간 3회 반복 세척한 후 WestGlowTM MAX ECL chemi luminescent substrate(Biomax Ltd., KOREA)을 사용하여 단백질을 검출하였다.
9. Total RNA 분리 및 Real-time PCR (polymerase chain reaction)
B16F10 세포를 24 well plate에 3×105 cells/well씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양액을 제거하고 각 추출물을 농도별로 24시간 처리하였다. Apure Total RNA isolation kit(APBIO Co. Ltd., KOREA)를 이용하여 total RNA를 분리하고, 추출한 RNA(2 ㎍)를 Table 1과 같이 제작된 primer를 사용하여 Real-time PCR(TaKaRa, Japan)을 수행하였다(Lee et al., 2016).
III. 결과 및 고찰
1. 추출물의 수율
미라클프룻 씨앗 건조중량 10 g과 잎 건조중량 30 g을 사용하여 70% methanol로 추출한 결과 최종수율은 SDS가 28.4%, SDL이 24.7%로 확인되었다(Table 2). 본 연구에서는 미라클 잎 70% 메탄올 추출 조건에 의한 탁월한 항산화 효능을 보고한 연구 결과를 바탕으로 추출 용매를 70% 메탄올로 선택하여 추출물을 제조하였으며, 특히 메탄올 용매는 다양한 성분 추출 및 추출 후 분리 정제가 용이하므로 식물체에서 생리활성 물질 추출에 가장 많이 사용된다(Liu et al., 2017).
2. 총 폴리페놀 함량 분석 결과
대표적인 총 폴리페놀 화합물 측정법인 Folin-Ciocalteu (F-C) 시약을 사용하는 Folin-Denis 방법으로 미라클프룻 씨앗과 잎 메탄올추출물에 포함되어 있는 폴리페놀 함량을 측정하였다(Folin and Denis, 1912). 70% 메탄올 용매로 추출한 SDS와 SDL의 폴리페놀 함량은 각각 18.76 mgGAE/g, 71.42 mgGAE/g으로 SDL이 3.8배 더 높은 폴리페놀 함량을 나타냈다(Table 2). 이는 50% 에탄올 용매로 추출한 씨앗의 폴리페놀 함량이 11.56 mg/g 일 때, 과피와 과육의 폴리페놀 함량이 각각 52.72 mg/g, 16.95 mg/g으로 확인된 연구(Inglett & Chen, 2011)와 잎 메탄올추출물의 HPLC 분석결과 rutin, quercetin, kaempferol, caffeic acid, catechin, gallic acid, tocopherol, β-carotene 등의 폴리페놀 성분을 보고한 결과(Obafemin et al., 2017)를 바탕으로 미라클프룻 잎 메탄올추출물의 천연 항산화제로서의 활용 가능성이 매우 높다고 사료된다.
3. 항산화 효과
1) DPPH 음이온 라디컬 소거능
DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) assay는 식물 추출물, 식품 및 단일 화합물의 항산화 효능을 측정하는데 널리 사용되는 빠르고 간단한 항산화 측정법 중 하나이다(Blois, 1958). 각 추출물 농도(0.01, 0.02, 0.05, 0.1 mg/ml)에 따른 SDS의 DPPH 라디컬 소거능은 4.35%, 6.47%, 20.91%, 41.40%로, SDL의 경우 17.19%, 36.94%, 79.51%, 94.58%로 나타났다(Fig. 1A). 이러한 결과는 미라클프룻 과육(flesh)과 씨앗을 메탄올(60℃)로 추출한 후, 각 추출물(1 mg/ml)의 DPPH 라디컬 소거능을 과육 96.3%, 씨앗 50%로 보고한 선행연구와 비교하여 볼 때 SDL의 DPPH 항산화 활성이 매우 우수함을 알 수 있다(Du et al., 2013).
2) ABTS 양이온 라디컬 소거능
ABTS assay는 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 양이온(ABTS․+)에 대한 항산화제의 소거능을 측정하는 방법으로 친수성 시료뿐만 아니라 친유성(lipophilic) 시료의 항산화능 측정에 모두 사용 가능하므로 소수성(hydrophobic) 시료 측정에 제한적인 DPPH radical 분석법에 비해 다양한 시료의 항산화능 측정에 사용된다(Roberta et al., 1999). 각 추출물 농도(0.01, 0.02, 0.05, 0.1 mg/ml)에 따른 SDS의 ABTS 양이온 라디컬 소거능은 0%, 0.21%, 3.19%, 7.55%로, SDL의 경우 0%, 6.32%, 17.73%, 36.62%로 나타났으며, 최고농도 0.1 mg/ml 조건에서 SDL의 ABTS 양이온 라디컬 소거능(36.62%)은 SDS(7.55%)보다 4.8배 높은 것으로 확인되었다(Fig. 1B).
4. 추출물에 의한 세포 생존율
MTT assay와 달리 수용성 formazane을 형성하는 water soluble tetrazolium salts(WST)는 세포를 washing하는 단계에서 세포 손실이 없고 높은 감도가 특징이다(Kamiloglu et al., 2020). 미라클프룻 씨앗과 잎 추출물이 RAW264.7세포와 B16F10세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각 세포에 추출물을 농도별(0.01, 0.02, 0.05, 0.1 mg/mL)로 처리하고 24 h 후 세포 생존율을 측정한 결과 두 가지 세포주에서 추출물에 의한 세포 독성은 관찰되지 않았다(Fig. 2). 이는 미라클프룻 줄기, 열매, 잎의 메탄올 또는 에탄올추출물을 THP-1(acute monocytic leukemia cell), nHDF (normal human dermal fibroblast) 세포에 200 ㎍/ml 최고농도를 시작으로 2배수 희석하여 처리한 결과 세포 독성이 없음을 보고한 연구결과와 맥을 같이 한다(Seong et al., 2018).
5. 미백 효과
1) 체외 Tyrosinase 활성 저해능
미라클프룻 씨앗과 잎 추출물의 tyrosinase 저해활성을 L-tyrosine 기질을 사용하여 측정 결과 Fig. 3과 같았다. 각 추출물 농도(0.01, 0.02, 0.05, 0.1 mg/ml)에 따른 SDS의 tyrosinase 저해능은 2.86%, 8.10%, 12.87%, 15.50%로, SDL은 6.18%, 9.77%, 14.72%, 16.45%로 나타났으며, 모든 추출물 농도가 증가함에 따라 억제활성이 증가하였다. 또한 최고 농도 0.1 mg/ml 조건에서 양성대조군 arbutin(AR)의 저해활성이 32% 일 때, SDS는 15.5%, SDL은 16.4%로 확인되었다(Fig. 3A). 미라클프룻 줄기 메탄올추출물로부터 분리된 13가지 성분 중 총 7가지 성분들의 L-tyrosine을 기질로 이용하여 mushroom tyrosinase 억제능(IC50)을 조사한 결과 kojic acid가 68.2 uM일 때, 168.7-358.6 uM을 나타냈다는 연구결과가 보고되었다(Wang et al., 2011).
2) 체외 L-DOPA 산화 억제능
Tyrosinase 효소의 기질인 L-DOPA 산화반응 저해능을 수행한 결과 각 추출물 농도(0.01, 0.02, 0.05, 0.1 mg/ml)에 따른 DOPA 산화 반응 저해능은 SDS가 4.11%, 9.73%, 11.40%, 14.55%로, SDL이 6.20%, 10.53%, 12.72%, 18.56%로 나타났으며, 체외 tyrosinase 활성 저해 결과와 마찬가지로 양성대조군인 AA(ascorbic acid)에 비해 낮은 수준이었으나 두 추출물 모두 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 3B). 이러한 L-DOPA의 dopaquinone으로의 산화 억제 측정법은 L-tyrosine의 L-dopa 하이드록시화(hydroxylation) 저해능 측정법과 함께 피부의 미백에 도움을 주는 기능성화장품 유효성평가 가이드에 기술된 미백성분의 효과를 평가하는 필수 분석 방법 중 하나이다(식품의약품안전처, 2020. 9).
또한 선행연구 결과 미라클프룻 열매 메탄올추출물과 과육 클로로포름 추출물의 tyrosinase 억제 농도(IC50)가 75.6 ㎍/mL, 64.6 ㎍/mL으로 보고되었으며(Chen et al., 2009), 이는 본 연구 결과와 함께 미라클프룻의 열매뿐만 아니라 씨앗 및 잎부분 또한 멜라닌색소 형성에 핵심 효소인 tyrosinase를 저해시킴으로써 미백 효능 물질 후보로서 활용 가치가 높을 것으로 사료된다.
3) 멜라닌 생성 저해능
멜라닌 생성 억제 효능을 조사하기 위해 피부에서 melanin을 합성하는 melanocyte의 한 종류인 B16F10 세포를 이용하였으며 독성이 없는 농도에서 진행하였다. 먼저 B16F10 세포에 α-MSH를 처리하여 melanin 생성을 촉진시킨 후 미라클프룻 씨앗과 잎 추출물을 농도별로 첨가한 후 세포 배양액으로 분비된 멜라닌 양을 측정한 결과 Fig. 4와 같다. B16F10 세포만 배양한 무처리군의 멜라닌 생성량을 100%로 기준하였을 때, α-MSH 처리 후 증가된 멜라닌 양은 288%, 양성 대조군 Kojic acid (KA)에 의해 감소된 멜라닌 양은 202%로 나타났다. 각 추출물 농도(0.02, 0.05, 0.1 mg/ml)에 따른 멜라닌 생성량은 SDS가 281%, 255%, 234%로, SDL이 253%, 229%, 198%로 감소되었다(Fig. 4).
4) 멜라닌 생성 유전자의 단백질과 mRNA 발현 감소
미라클프룻 씨앗과 잎 추출물이 멜라닌 생성 유전자 MITF, tyrosinase 및 TRP-1 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 α-MSH로 멜라닌 생성을 유발시킨 B16F10 세포에 각 추출물을 처리한 후 western blotting 분석법을 수행한 결과 Fig. 5와 같다. 그 결과 α-MSH 처리 후 증가된 MITF, tyrosinase, TRP-1 유전자 단백질 발현 수준이 SDS와 SDL 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 5).
또한 이들 유전자의 mRNA 수준을 real-time PCR 분석법으로 확인한 결과 잎 추출물이 씨앗추출물 보다 MITF, tyrosinase 및 TRP-1 mRNA 발현 저해 효능이 우수하였다(Fig. 6).
IV. 결 론
본 연구는 노화의 대표적인 원인 중 한 가지인 라디컬 생성 저해능과 melanin 합성 억제능을 조사하여 미라클프룻 씨앗과 잎이 미백 기능성 화장품으로서 활용 가능한지를 조사하였다. 먼저 미라클프룻 씨앗(SDS)과 잎(SDL) 메탄올추출물의 최종수율은 각각 28.4%, 24.7%로 확인되었다. 항산화 효능을 위한 DPPH 라디털 소거능, ABTS 라디컬 소거능 결과 SDS와 SDL 농도 증가에 따른 소거능이 높게 나타났으며, SDL의 항산화 효능이 SDS 추출물보다 더 우수하였다. 게다가 SDL에 함유된 총 폴리페놀 성분은 71.42 mgGAE/g으로 SDS(18.76 mgGAE/g) 보다 3.8배 높게 폴리페놀을 함유하는 것으로 나타났다. 미백 효능을 위해 각각 L-tyrosine과 L-DOPA 기질을 사용한 tyrosinase 활성 억제능, 멜라닌 생성 저해능, 멜라닌 생성 관련 유전자의 단백질 및 유전자 발현 수준을 조사하였다. 그 결과 SDS와 SDL은 L-tyrosine과 L-DOPA 두 기질에 대한 tyrosinase 활성을 추출물 농도 의존적으로 억제하였으며, B16F10 세포에 α-MSH 처리 후 증가된 멜라닌 생성을 저해시켰다. 또한 세포 내 멜라닌 생성에 관련된 유전자의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 western blotting과 real-time PCR 분석법을 통해 확인한 결과 SDL이 MITF, tyrosinase 및 TRP-1 유전자의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 현저하게 감소시켰다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 미라클프룻 잎 메탄올추출물은 항산화 및 멜라닌 생합성을 억제하는 효능의 기능성 화장품 원료로서 가치가 높다고 판단된다.
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